짧은 답
당을 함유한 배지라면 121 °C 고압증기멸균(오토클레이브) 후 pH가 0.2~0.4 떨어지는 것은 정상이며, 건조배지 규격서의 "최종 pH"는 멸균 후의 값입니다. 0.5 이상 떨어지거나 배지가 눈에 띄게 어두워져서 나왔다면 과열되었거나 조성에 당과 인산염이 많이 들어 있다는 뜻이므로, 사이클을 조정하거나 성분을 따로 멸균해야 합니다. 멸균 후 pH를 다시 조정하려고 용기를 열면 오염 위험이 생기므로, 조성상 꼭 필요한 경우에만 하십시오.
pH가 떨어지는 이유
세 가지 기전이 있으며, 대개 동시에 일어납니다.
- 마이야르 반응. 환원당(포도당, 유당)이 고온에서 아미노산과 반응하여 유기산과 갈색 물질을 만듭니다. 이것이 주된 원인입니다. 당이 많을수록, 온도가 높을수록, 시간이 길수록 pH 저하와 착색이 커집니다.
- 당의 캐러멜화와 분해. 포도당은 그 자체로도 가열하면 산성 산물로 분해되며, 특히 알칼리성 용액에서 심합니다.
- 인산염과 이산화탄소. 고압증기멸균은 용존 CO₂를 용액 밖으로 밀어내어 pH를 올리고, 식으면서 다시 녹아 들어가 pH가 내려옵니다. 인산염 완충 배지는 이 단계에서 거의 움직이지 않지만, 완충되지 않은 배지는 더 크게 흔들립니다.
따라서 멸균 전 pH와 멸균 후 pH는 서로 다른 두 숫자이며, 규격서와 시험법은 후자를 기재합니다. 배지를 조제할 때는 저하분을 감안하여 멸균 전 pH를 설정하십시오. 그래서 대부분의 건조배지 사용 설명서가 "7.2로 조정"이 아니라 "멸균 후 pH 7.2 ± 0.2"라고 적는 것입니다.
정상 범위는 어느 정도입니까
| 배지 종류 | 고압증기멸균 후 pH 저하 | 비고 |
|---|---|---|
| 당 없음(Nutrient Broth, BPW) | 0~0.1 | 거의 변화 없음 |
| 포도당 0.25~0.5%(TSB, TSA, PCA) | 0.1~0.3 | 정상 |
| 포도당 2%(SDA, YPD, MRS) | 0.2~0.5 | 정상, 약간 어두워짐 |
| 당 4% 이상 또는 유당 | 0.3~0.6 이상 | 당을 따로 멸균 |
이 범위를 벗어나면 먼저 오토클레이브를 확인하십시오. 실제 온도가 121 °C를 넘는지, 가열과 냉각이 느리지 않은지(큰 병에서는 고온에 머무는 시간이 설정 시간보다 훨씬 길어집니다), 배지를 두 번 멸균하지 않았는지입니다.
성분을 따로 멸균해야 하는 경우
- 당이 2%를 넘는 발효 배지: 당을 농축액으로 따로 멸균하거나 0.2 µm로 여과하여, 식은 뒤에 첨가합니다.
- 고농도 인산염과 마그네슘 또는 칼슘이 함께 있는 경우: 함께 고압증기멸균하면 인산마그네슘과 인산칼슘이 백색 침전으로 가라앉습니다. 따로 멸균한 뒤 합치십시오.
- 비타민과 열에 약한 성장인자: 여과 멸균하여 첨가하고, 절대 고압증기멸균하지 마십시오.
건조배지는 이미 이 점을 감안하여 설계되어 있습니다. 표시된 농도와 조건으로 조제하면 별도 처리 없이 규정된 pH 범위에 들어옵니다. 분리 멸균은 자체 발효 조성에 해당하는 이야기입니다.
멸균 후 pH를 다시 조정해야 합니까?
일상적인 시험용 배지라면 아닙니다. 용기를 여는 것은 오염 기회를 하나 더 만드는 것이고, 규격은 멸균 후 값을 기준으로 하므로 범위 내라면 적합합니다.
발효 배지라면, 멸균 후 pH가 목표에서 0.2 이상 벗어났을 때 매 배치를 사후에 보정하기보다 다음 배치가 목표에 들어오도록 멸균 전 설정값을 바꾸는 것이 더 좋은 해결책입니다. 꼭 보정해야 한다면 여과 멸균한 산이나 염기를 무균 조건에서 첨가하십시오.
무엇으로 어떻게 조정하는지는 배지 pH 조정을 참고하십시오.
자주 묻는 질문
pH가 많이 떨어졌고 배지가 훨씬 어두워졌습니다. 그래도 사용할 수 있습니까? 어두운 색은 마이야르 반응이 많이 진행되었다는 뜻입니다. 당이 소모되었고 증식 억제 물질이 일부 생성되었습니다. 시험용 배지는 다시 만드십시오. 발효 배지는 균주의 내성에 따라 다르지만 대개 수율이 떨어집니다. 원인과 대책은 고압증기멸균 후 배지가 어두워지거나 탁해지는 경우를 참고하십시오.
압력솥은 실험실 오토클레이브와 pH 저하가 다릅니까? 예, 실제 가열 시간이 다르기 때문입니다. 가정용 압력솥은 가열이 느리고 냉각은 더 느려서 배지가 설정한 15분보다 훨씬 오래 고온에 머무릅니다. 1리터 이상의 병도 마찬가지입니다. 설정 시간을 줄이거나 더 작은 병을 사용하십시오.
같은 건조배지인데 배치마다 pH가 다르게 나옵니다. 품질 문제입니까? 먼저 각 배치가 규정 범위 내인지 확인하십시오. 같은 분말 로트와 같은 오토클레이브라면 배치 간 변동은 0.1 이내여야 합니다. 0.2 이상 벌어진다면 대개 오토클레이브 적재량이나 수질(수돗물의 경도와 알칼리도) 때문이므로, 비교하기 전에 이 두 변수를 먼저 바로잡으십시오.