짧은 답
지연기가 길어지는 가장 흔한 원인은 순서대로 다음과 같습니다. 종균의 나이가 맞지 않음(너무 늙었거나 너무 어림), 종배양 배지와 생산 배지의 차이가 너무 큼(세포가 다시 적응해야 함), 접종량이 너무 적음, 배지를 과도하게 멸균하여 생긴 억제 물질, 미량원소나 비타민의 결핍, 삼투압이 너무 높음, 온도나 pH가 범위를 벗어남입니다. 종균을 먼저 확인하십시오. 가장 자주 간과되면서 가장 바꾸기 쉬운 항목입니다. 배지 문제는 대개 함께 돌리는 소규모 진탕 플라스크 대조군에서 드러납니다.
1. 종균 상태
- 나이. 대수기 후반에 채취한 종균이 지연기가 가장 짧습니다. 정지기까지 둔 종균에는 이미 사멸로 향하는 세포가 들어 있어 증식 전에 회복이 필요하고, 너무 어린 종균은 밀도가 부족합니다. 대부분의 세균은 OD가 최대치의 70~80%에 도달했을 때 이식하십시오.
- 계대 수. 냉동 바이알에서 꺼낸 뒤 2~3번째 계대가 가장 안정적입니다. 냉동 바이알이나 사면배지에서 바로 생산 배지에 접종하면 항상 지연기가 길어집니다.
- 손상. 원심분리, 저온 보관, 격렬한 진탕은 세포를 회복 모드로 들어가게 합니다.
2. 종배양 배지와 생산 배지의 차이가 너무 큼
세포가 종배양 배지에서 질소원, 당, pH, 삼투압이 다른 생산 배지로 옮겨지면, 먹기 전에 새로운 효소 세트를 먼저 합성해야 합니다. 전형적인 예는 종배양은 TSB나 LB에서 하고 생산은 황산암모늄 기반의 합성배지에서 하는 경우, 또는 종배양은 포도당으로 하고 생산은 설탕이나 유당으로 하는 경우입니다.
해결책: 종배양 배지를 생산 배지에 최대한 가깝게 맞추십시오. 최소한 질소원과 탄소원의 종류는 같아야 합니다. 또는 "절반 생산" 배지에서 한 단계 종배양을 추가하여 다리를 놓으십시오.
3. 접종량
약 1%(v/v) 아래로 내려가면 지연기가 눈에 띄게 길어집니다. 세포가 먼저 배지를 조건화해야 하는데(산화환원전위, 일부 미량 성분), 세포 수가 적으면 그만큼 느려지기 때문입니다. 대부분의 발효는 5~10%를 쓰고, 까다로운 균은 10% 이상을 씁니다.
4. 멸균에서 생긴 억제 물질
당과 아미노산의 마이야르 산물, 침전된 인산염과 금속 이온, 과열로 생긴 과산화물은 모두 지연기를 늘리거나 증식을 직접 억제합니다. 시험: 같은 조성에서 당을 따로 고압증기멸균하거나 여과하여 첨가한 것과 지연기를 비교합니다. 차이가 뚜렷하면 멸균이 원인입니다. 고압증기멸균 후 배지가 어두워지거나 탁해지는 경우를 참고하십시오.
5. 미량원소나 성장인자의 결핍
합성배지나 무기 질소를 주로 쓰는 배지에서 가장 흔합니다. 마그네슘, 철, 망간, 아연이나 B군 비타민, 비오틴이 부족하면 세포는 증식을 멈추는 것이 아니라 매우 느리게 자랍니다. 망간이 부족한 유산균과 비오틴이 부족한 효모가 대표적인 사례입니다. 빠른 시험: 효모 추출물 0.1~0.3%를 첨가합니다. 지연기가 크게 짧아지면 성장인자나 미량원소가 빠진 것이므로, 그다음에 어느 것인지 좁혀 가십시오.
6. 삼투압
당과 염류의 총량이 높으면(예를 들어 당을 처음에 모두 넣는 회분식 발효) 세포는 먼저 높은 삼투압에 적응해야 합니다. 당 5% 이상의 조성은 유가식(fed-batch)을 고려하고, 염류 쪽에서는 완충 목적으로 인산염과 황산암모늄을 과량 넣지 않았는지 확인하십시오.
7. 온도와 pH
접종 시점에 배지가 아직 설정 온도에 도달하지 않은 경우(큰 조는 멸균 후 천천히 식고 중심부는 뜨거운 상태로 남습니다)나, 멸균 후 pH가 균주의 범위를 벗어난 경우입니다. 설정값이 아니라 접종하는 순간의 실제 값을 읽으십시오. pH는 고압증기멸균 후 배지 pH가 떨어지는 경우를 참고하십시오.
원인을 빨리 찾는 방법
한 번에 한 요인씩 바꾸는 것은 느립니다. 소형 플라스크 한 세트를 동시에 돌리십시오.
- 원래 조성 + 원래 종균(대조군)
- 원래 조성 + 신선한 대수기 종균
- 원래 조성 + 접종량 2배
- 원래 조성 + 효모 추출물 0.2%
- 원래 조성에서 당만 따로 멸균
어느 플라스크에서 지연기가 뚜렷하게 짧아지는지가 하루 안에 원인을 가리킵니다.
자주 묻는 질문
지연기는 길지만 최종 수율은 정상입니다. 고쳐야 합니까? 비용의 문제입니다. 지연기 4시간은 조 점유 시간 4시간, 통기와 교반 전력 4시간, 그리고 오염 위험 증가를 뜻합니다. 지연기는 길지만 수율이 정상인 경우는 대개 종균의 나이가 원인이므로, 이식 시점을 조정하십시오.
같은 균주가 예전 펩톤에서는 빨리 자라는데 새 펩톤에서는 지연됩니다. 왜 그렇습니까? 로트나 브랜드가 다르면 가수분해 정도가 다릅니다. 작은 펩타이드와 유리 아미노산이 적으면 세포가 큰 분자를 분해하기 위해 먼저 단백질분해효소를 분비해야 이용할 수 있으므로 지연기가 길어집니다. COA의 아미노태 질소 비율을 확인하거나 펩톤 로트를 바꾼 뒤 수율이 떨어진 경우를 참고하십시오.
효모 추출물을 추가하면 제품 규격이 바뀝니까? 원료가 하나 추가되는 것이므로, 식품 등급 공정에서는 그 유래와 문서를 확인해야 합니다. STBIO의 효모 추출물과 효모 펩톤은 식품 등급이며 로트별 COA가 있습니다. 효모 펩톤을 참고하십시오.