Jawaban singkat
Sebagian besar variasi hitung cawan berasal dari teknik, bukan dari media. Empat faktor terbesar: pengencer (jenis, suhu, waktu tunggu), suhu media saat dituang, rentang jumlah koloni yang Anda terima, dan apakah sampel telah dihomogenisasi. Variasi antar lot pada media yang memenuhi spesifikasi biasanya di bawah 10%, sementara teknik secara rutin menyumbang 30 sampai 50%. Telusuri teknik terlebih dahulu dan uji media dengan galur acuan paling akhir.
Kenali seperti apa yang normal
Hitung cawan membawa variasi statistik yang melekat. Dua cawan duplikat pada pengenceran yang sama, keduanya dengan 30 sampai 300 koloni, secara normal berbeda 10 sampai 20% menurut distribusi Poisson; cawan dengan hanya 10 koloni dapat berbeda 50% tanpa ada yang salah. Jadi pemeriksaan pertama adalah memastikan Anda membandingkan cawan dalam rentang 30 sampai 300 (atau rentang apa pun yang ditetapkan metode); cawan di bawah 25 sama sekali tidak boleh dihitung.
Memeriksa menurut urutan dampak
1. Pengencer
- Jenis. Gunakan yang ditetapkan metode. Air pepton 0,1%, air pepton berbufer, bufer fosfat, dan larutan garam fisiologis berbeda dalam kemampuannya memulihkan sel yang cedera; air biasa membunuh sel melalui syok osmotik.
- Suhu. Pengencer yang langsung dari lemari pendingin memberi syok dingin pada sel. Biarkan mencapai suhu ruang.
- Waktu tunggu. Selesaikan penuangan dalam 15 sampai 20 menit setelah pengenceran; sel mati atau berkembang biak dalam pengencer yang dibiarkan berdiri.
- Volume. Tabung pengenceran 9 mL yang menguap menjadi 8,5 mL di autoklaf menimbulkan galat 5% per tahap, 15% dalam tiga tahap. Periksa volume setelah sterilisasi.
2. Suhu penuangan
Pertahankan media pada 44 sampai 46 °C. Terlalu panas (di atas 48 °C) membunuh sebagian sel, terutama yang cedera; terlalu dingin membuat media memadat lebih awal dan tercampur tidak merata. Kalibrasi termometer penangas air, dan beri waktu 30 menit atau lebih setelah botol dimasukkan ke penangas sebelum benar-benar mencapai suhu.
3. Ketebalan cawan dan pengeringan
Tuang 15 sampai 20 mL. Cawan yang tipis mengering dalam 48 jam dan koloni tetap kecil; cawan yang tebal menyembunyikan koloni di lapisan bawah. Untuk cawan sebar, keringkan permukaan sampai tidak ada tetesan yang tersisa, atau koloni akan menyatu.
4. Penyimpanan media
Gunakan cawan yang sudah dituang dalam 7 sampai 14 hari penyimpanan dingin, dalam kantong untuk mencegah pengeringan; cawan yang disimpan lebih lama memiliki permukaan yang terdehidrasi dan memberikan hitungan rendah. Tutup kembali serbuk yang sudah dibuka agar terlindung dari kelembapan; lihat Menyimpan media kering dan masa simpan.
5. Rentang penghitungan dan pembacaan
25 sampai 250 atau 30 sampai 300, sesuai yang dinyatakan metode. Jika hanya satu pengenceran yang berada dalam rentang, gunakan hanya yang itu; jika dua, terapkan rumus berbobot dari metode, bukan rata-rata sederhana. Analis yang sama menghitung ulang cawan yang sama seharusnya sepakat dalam 5%, analis yang berbeda dalam 10%; di luar itu, selaraskan kriteria pembacaan (apa yang dihitung sebagai satu koloni, bagaimana koloni menyebar ditangani).
6. Kondisi inkubasi
Suhu inkubator tidak seragam; rak atas dan bawah dapat berbeda 2 °C, dan tumpukan cawan menghangat lambat di bagian tengah. Perbedaan 2 °C atau 4 jam dapat menggeser hitungan aerob 48 jam sebesar 20%.
7. Homogenisasi sampel
Sampel padat yang tidak terhomogenisasi sempurna atau cairan yang tidak dikocok membuat 1 mL yang Anda ambil tidak representatif. Ini sumber variasi antar sampel yang terbesar dan tidak ada hubungannya dengan media.
8. Media itu sendiri
Hanya setelah semua di atas disingkirkan, uji media dengan galur acuan. Inokulasi secara kuantitatif dengan galur ATCC (misalnya E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25923), lima cawan masing-masing untuk lot lama dan lot baru, dan bandingkan pemulihannya. Perbedaan di atas 30%, atau pemulihan pada lot baru di bawah yang dipersyaratkan metode, menunjukkan masalah media. STBIO mengirimkan COA bersama setiap lot dan data respons kultur tersedia untuk perbandingan.
Daftar periksa
| Butir | Standar |
|---|---|
| Pengencer | Jenis yang ditetapkan metode, suhu ruang, volume diperiksa setelah sterilisasi |
| Pengenceran sampai penuangan | Dalam 20 menit |
| Suhu media | 44 sampai 46 °C, diukur |
| Volume tuang | 15 sampai 20 mL |
| Penyimpanan cawan | Didinginkan, dalam kantong, dalam 14 hari |
| Rentang penghitungan | Sesuai metode; tidak pernah di bawah 25 |
| Inkubator | Terkalibrasi; tumpukan tidak lebih dari 6 cawan |
| Kontrol | Galur kontrol positif dan blanko pada setiap batch |
FAQ
Hitungan turun setelah berganti merek media. Apakah merek baru lebih buruk? Tidak selalu. Merek berbeda dalam batas spesifikasi, tetapi lebih sering penyiapannya ikut berubah bersama merek (gram per liter, waktu sterilisasi). Bandingkan secara berdampingan dengan galur acuan, lima cawan per merek, dan lihat pemulihannya.
Cawan duplikat berbeda dua kali lipat. Ulangi? Jika kedua hitungan berada dalam rentang dan masih berbeda dua kali lipat, itu melampaui variasi statistik; ulangi, dan periksa pencampuran pengencer serta teknik pemipetan.
Pepton mana untuk pengencer pepton 0,1%? Pepton bakteriologis biasa, misalnya Peptone, Bacteriological; inilah yang ditetapkan metode pangan Taiwan FDA dan sebagian besar metode internasional.