Jawaban singkat
Penyebab paling umum fase lag yang panjang, berurutan: kultur benih dengan umur yang keliru (terlalu tua atau terlalu muda), perbedaan terlalu besar antara media benih dan media produksi (sel harus beradaptasi ulang), inokulum terlalu kecil, penghambat yang dihasilkan oleh sterilisasi media yang berlebihan, kekurangan unsur renik atau vitamin, tekanan osmotik terlalu tinggi, serta suhu atau pH di luar rentang. Periksa benih terlebih dahulu: ini yang paling sering terlewat dan paling mudah diubah. Masalah media biasanya muncul dalam serangkaian kecil kontrol labu kocok yang dijalankan bersamaan.
1. Kondisi benih
- Umur. Benih yang diambil pada fase log akhir memberikan lag terpendek. Benih yang dibiarkan masuk fase stasioner mengandung sel yang sudah menuju kematian dan harus memperbaiki diri sebelum tumbuh; benih yang terlalu muda kurang padat. Untuk sebagian besar bakteri, pindahkan saat OD mencapai 70 sampai 80% dari maksimumnya.
- Jumlah pasase. Pasase kedua atau ketiga dari vial beku adalah yang paling stabil. Menginokulasi media produksi langsung dari kriovial atau agar miring selalu memberikan lag yang panjang.
- Cedera. Sentrifugasi, penyimpanan dingin, dan pengocokan yang keras membuat sel masuk ke mode perbaikan.
2. Media benih dan media produksi terlalu berbeda
Ketika sel berpindah dari media benih ke media produksi dengan sumber nitrogen yang berbeda, gula yang berbeda, pH dan tekanan osmotik yang berbeda, sel harus mensintesis seperangkat enzim baru sebelum dapat makan. Contoh umum: benih dalam TSB atau LB, produksi dalam media terdefinisi berbasis amonium sulfat; atau benih dengan glukosa, produksi dengan sukrosa atau laktosa.
Perbaikan: dekatkan media benih sebisa mungkin ke media produksi, minimal kelas sumber nitrogen dan karbon yang sama; atau tambahkan satu tahap benih dalam media "setengah produksi" sebagai jembatan.
3. Ukuran inokulum
Di bawah sekitar 1% (v/v), lag memanjang secara nyata, karena sel harus terlebih dahulu mengondisikan media (potensial redoks, beberapa komponen renik) dan sel yang lebih sedikit melakukannya lebih lambat. Sebagian besar fermentasi menggunakan 5 sampai 10%; organisme yang sulit lebih dari 10%.
4. Penghambat dari sterilisasi
Produk Maillard dari gula dan asam amino, fosfat dan ion logam yang mengendap, serta peroksida dari pemanasan berlebih semuanya memperpanjang lag atau menghambat pertumbuhan sepenuhnya. Uji: formulasi yang sama dengan gula diautoklaf terpisah atau ditambahkan lewat penyaringan, dibandingkan lag-nya. Perbedaan yang jelas menunjuk pada sterilisasi. Lihat Media berubah gelap atau keruh setelah autoklaf.
5. Kekurangan unsur renik atau faktor pertumbuhan
Paling umum pada media terdefinisi atau media yang terutama berbasis nitrogen anorganik. Kekurangan magnesium, besi, mangan, atau seng, atau vitamin B atau biotin, tidak membuat sel berhenti tumbuh; sel tumbuh sangat lambat. Bakteri asam laktat yang kekurangan mangan dan khamir yang kekurangan biotin adalah kasus klasiknya. Uji cepat: tambahkan 0,1 sampai 0,3% ekstrak ragi. Jika lag memendek tajam, ada faktor pertumbuhan atau unsur renik yang kurang; kemudian persempit yang mana.
6. Tekanan osmotik
Total gula plus garam yang tinggi (misalnya fermentasi batch dengan seluruh gula ditambahkan di awal) memaksa sel beradaptasi dengan osmolaritas tinggi terlebih dahulu. Untuk formulasi di atas 5% gula, pertimbangkan fed-batch; di sisi garam, periksa apakah fosfat dan amonium sulfat telah diberikan berlebihan untuk pembuferan.
7. Suhu dan pH
Media belum mencapai suhu yang diatur saat diinokulasi (tangki besar mendingin lambat setelah sterilisasi dan bagian intinya tetap panas), atau pH setelah sterilisasi di luar rentang galur. Baca nilai aktual pada saat inokulasi, bukan titik setelnya. Untuk pH, lihat pH media turun setelah autoklaf.
Menemukan penyebab dengan cepat
Mengubah satu faktor pada satu waktu itu lambat. Jalankan satu set labu kecil secara paralel:
- Formulasi asli + benih asli (kontrol)
- Formulasi asli + benih segar fase log
- Formulasi asli + inokulum dua kali lipat
- Formulasi asli + 0,2% ekstrak ragi
- Formulasi asli dengan gula disterilkan terpisah
Labu mana pun yang memperpendek lag secara jelas menunjuk pada penyebabnya, dalam satu hari.
FAQ
Lag-nya panjang tetapi hasil akhir normal. Perlukah saya memperbaikinya? Ini pertanyaan biaya. Empat jam lag tambahan berarti empat jam tambahan okupansi tangki, daya aerasi dan agitasi, dan risiko kontaminasi yang lebih besar. Hasil normal dengan lag panjang paling sering disebabkan umur benih; sesuaikan titik pemindahannya.
Galur yang sama tumbuh cepat pada pepton lama dan lag pada pepton baru. Mengapa? Lot atau merek yang berbeda memiliki derajat hidrolisis yang berbeda. Dengan lebih sedikit peptida kecil dan asam amino bebas, sel harus terlebih dahulu mensekresikan protease untuk memecah molekul yang lebih besar sebelum dapat memanfaatkannya, sehingga lag memanjang. Periksa rasio nitrogen amino pada COA, atau lihat Hasil turun setelah ganti lot pepton.
Apakah menambahkan ekstrak ragi akan mengubah spesifikasi produk saya? Ini menambah satu bahan baku; proses food grade harus mengonfirmasi asal dan dokumentasinya. Ekstrak ragi dan pepton ragi STBIO adalah food grade dengan COA per lot; lihat pepton ragi.