짧은 답
평판 계수 변동의 대부분은 배지가 아니라 기법에서 옵니다. 가장 큰 네 가지 요인은 희석액(종류, 온도, 방치 시간), 분주할 때의 배지 온도, 허용하는 집락 수 범위, 그리고 시료를 균질화했는지입니다. 규격을 충족하는 배지의 로트 간 변동은 대개 10% 미만이지만, 기법은 흔히 30~50%의 변동을 끌어들입니다. 기법을 먼저 점검하고, 배지는 마지막에 표준균주로 시험하십시오.
정상이 어떤 모습인지 알아 두기
평판 계수에는 본래 통계적 변동이 있습니다. 같은 희석 단계의 중복 평판 두 장이 모두 30300 집락이라면 푸아송 분포에 따라 1020% 차이는 정상이고, 집락이 10개뿐인 평판은 아무 문제가 없어도 50%까지 차이 날 수 있습니다. 따라서 첫 번째 확인 사항은 30~300(또는 시험법이 정한 범위) 안의 평판끼리 비교하고 있는지이며, 25 미만의 평판은 아예 계수하지 않아야 합니다.
영향이 큰 순서로 점검
1. 희석액
- 종류. 시험법이 정한 것을 쓰십시오. 0.1% 펩톤수, 완충 펩톤수(BPW), 인산 완충액, 생리식염수는 손상된 세포를 회복시키는 정도가 다르고, 순수한 물은 삼투 충격으로 세포를 죽입니다.
- 온도. 냉장고에서 바로 꺼낸 희석액은 세포에 저온 충격을 줍니다. 실온에 도달하게 두십시오.
- 방치 시간. 희석 후 15~20분 안에 분주를 끝내십시오. 방치된 희석액 안에서 세포는 죽거나 증식합니다.
- 용량. 9 mL 희석 시험관이 오토클레이브에서 증발하여 8.5 mL가 되면 단계마다 5%, 세 단계면 15%의 오차가 생깁니다. 멸균 후 용량을 확인하십시오.
2. 분주 온도
배지를 44~46 °C로 유지하십시오. 너무 뜨거우면(48 °C 이상) 세포의 일부, 특히 손상된 세포가 죽고, 너무 식으면 일찍 굳어 고르게 섞이지 않습니다. 항온수조 온도계를 교정하고, 병을 수조에 넣은 뒤 실제로 그 온도에 도달하기까지 30분 이상을 두십시오.
3. 평판 두께와 건조
15~20 mL를 분주하십시오. 얇은 평판은 48시간 동안 말라 집락이 작게 머물고, 두꺼운 평판은 아래층의 집락이 가려집니다. 도말 평판은 표면에 물방울이 남지 않을 때까지 건조하지 않으면 집락이 서로 번집니다.
4. 배지 보관
분주한 평판은 마르지 않도록 봉지에 넣어 냉장 보관하고 7~14일 안에 사용하십시오. 더 오래 둔 평판은 표면이 말라 계수가 낮게 나옵니다. 개봉한 분말은 습기가 들지 않도록 다시 밀봉하십시오. 건조배지 보관과 유효기간을 참고하십시오.
5. 계수 범위와 판독
시험법에 따라 25250 또는 30300입니다. 범위 안에 든 희석 단계가 하나뿐이면 그것만 쓰고, 둘이면 단순 평균이 아니라 시험법의 가중 공식을 적용하십시오. 같은 분석자가 같은 평판을 다시 세면 5% 이내, 다른 분석자 사이에서는 10% 이내로 일치해야 합니다. 그 이상이면 판독 기준(무엇을 집락 하나로 보는지, 확산 집락은 어떻게 처리하는지)을 통일하십시오.
6. 배양 조건
배양기 온도는 균일하지 않습니다. 위 칸과 아래 칸이 2 °C 차이 날 수 있고, 쌓아 둔 평판의 중간은 천천히 데워집니다. 2 °C 또는 4시간의 차이가 48시간 호기성 계수를 20% 바꿀 수 있습니다.
7. 시료 균질화
고형 시료를 충분히 균질화하지 않았거나 액체를 흔들지 않으면 채취한 1 mL가 대표성을 잃습니다. 시료 간 변동의 가장 큰 원인이며, 배지와는 무관합니다.
8. 배지 자체
위 항목을 모두 배제한 뒤에야 배지를 표준균주로 시험합니다. ATCC 균주(예: E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25923)를 정량 접종하여 구 로트와 신 로트 각 5장씩 회수율을 비교합니다. 30% 이상 차이가 나거나 신 로트의 회수율이 시험법 요구치에 미달하면 배지 문제입니다. STBIO는 모든 로트에 COA를 첨부하며, 비교용 배양 성능 자료를 요청 시 제공합니다.
점검표
| 항목 | 기준 |
|---|---|
| 희석액 | 시험법이 정한 종류, 실온, 멸균 후 용량 확인 |
| 희석에서 분주까지 | 20분 이내 |
| 배지 온도 | 44~46 °C, 실측 |
| 분주량 | 15~20 mL |
| 평판 보관 | 냉장, 봉지 포장, 14일 이내 |
| 계수 범위 | 시험법에 따름, 25 미만은 계수하지 않음 |
| 배양기 | 교정됨, 평판은 6장 이하로 쌓음 |
| 대조 | 매 배치마다 양성 대조 균주와 공시험 |
자주 묻는 질문
배지 브랜드를 바꾼 뒤 계수가 떨어졌습니다. 새 브랜드가 더 나쁜 것입니까? 꼭 그렇지는 않습니다. 브랜드마다 규격 안에서 차이가 있지만, 브랜드가 바뀌면서 조제 방법(리터당 그램 수, 멸균 시간)이 함께 바뀐 경우가 더 많습니다. 표준균주로 브랜드별 5장씩 나란히 비교하여 회수율을 보십시오.
중복 평판이 2배 차이 납니다. 다시 해야 합니까? 두 계수가 모두 범위 안인데도 2배 차이 난다면 통계적 변동을 넘어선 것입니다. 다시 하고, 희석액 혼합과 피펫 조작 기법을 확인하십시오.
0.1% 펩톤 희석액에는 어떤 펩톤을 씁니까? 일반적인 세균학용 펩톤입니다. 예를 들어 Peptone, Bacteriological이며, 대만 FDA 식품 시험법과 대부분의 국제 시험법이 이것을 지정합니다.