先給答案
平板計數的變異，大多出在操作而不是培養基。影響最大的四個：稀釋液（種類、溫度、放置時間）、傾注時培養基的溫度、取的菌落數範圍、檢體有沒有均質。培養基本身的批次差異，在合格的產品上通常小於 10%，而操作造成的差異動輒 30% 到 50%。排查時從操作開始，最後再用標準菌株測培養基。
先知道什麼叫正常
平板計數本來就有統計變異。同一個稀釋度兩個平行平板，菌落數在 30 到 300 之間時，差 10% 到 20% 是正常的泊松分布；菌落數只有 10 個的平板，差 50% 也不奇怪。所以第一件事是確認你比的是 30 到 300（或方法規定的範圍）之間的平板，低於 25 個的平板本來就不該拿來算。
依影響大小排查
1. 稀釋液
- 種類：方法規定什麼就用什麼。0.1% 蛋白腖水、緩衝蛋白腖水、磷酸鹽緩衝液、生理食鹽水，對受傷細胞的復甦能力不同，純水會讓細胞滲透壓休克直接死掉。
- 溫度：冰箱拿出來的稀釋液直接用，會讓細胞受冷休克。回到室溫再用。
- 放置時間：檢體稀釋後要在 15 到 20 分鐘內完成傾注，放久了菌會在稀釋液裡死亡或增殖。
- 體積：9 mL 稀釋管滅菌後蒸發剩 8.5 mL，每一級稀釋就差 5%，三級下來差 15%。滅菌後要校正體積。
2. 傾注溫度
培養基保溫在 44 到 46°C。太熱（超過 48°C）會燙死一部分細胞，特別是受傷的細胞；太冷則提早凝固、混不均勻。水浴的溫度計要校正，而且培養基瓶放進水浴後要等 30 分鐘以上才會真的到溫度。
3. 平板的厚度與乾燥
傾注 15 到 20 mL，太薄的平板培養 48 小時會乾掉、菌落長不大；太厚則下層菌落看不清。塗抹法的平板要先乾燥到表面沒有水珠，不然菌落會連成一片。
4. 培養基的保存
配好的平板冷藏 7 到 14 天內用完，裝袋避免失水；放超過時間的平板表面脫水，菌落數會偏低。粉末開封後要密封防潮，見粉末培養基的保存與有效期限。
5. 計數範圍與判讀
25 到 250 或 30 到 300，照方法。只有一個稀釋度在範圍內就只用那個；兩個都在範圍內要照方法的公式加權，不是直接平均。同一個人前後計數同一片平板應該在 5% 以內，不同人之間 10% 以內，超過就要校正判讀標準（哪些算一個菌落、擴散菌落怎麼算）。
6. 培養條件
培養箱內溫度不均，上層和下層可能差 2°C；平板疊太高中間的升溫慢。溫度差 2°C、時間差 4 小時，對 48 小時的生菌數影響可以到 20%。
7. 檢體均質
固體檢體均質不完全、液體檢體沒搖勻，取樣的那 1 mL 代表性就差，這是檢體間變異的最大來源，跟培養基無關。
8. 培養基本身
以上都排除了，才用標準菌株驗培養基。方法是用 ATCC 標準菌株（例如 E. coli ATCC 25922、S. aureus ATCC 25923）做定量接種，新舊批平板各五片，比較回收率；差異超過 30%，或新批次回收率低於方法要求，才是培養基問題。上鼎每批附 COA 與培養性能資料，可以索取比對。
一張檢查表
| 項目 | 標準 |
|---|---|
| 稀釋液 | 方法規定的種類，室溫，滅菌後校正體積 |
| 稀釋到傾注 | 20 分鐘內完成 |
| 培養基溫度 | 44 到 46°C，實測 |
| 傾注量 | 15 到 20 mL |
| 平板保存 | 冷藏、裝袋、14 天內 |
| 計數範圍 | 依方法，不算 25 以下 |
| 培養箱 | 校正溫度，平板不疊超過 6 片 |
| 對照 | 每批加陽性對照菌株與空白 |
常見問題
換了培養基品牌，菌落數變少了，一定是新品牌不好嗎？ 不一定。不同品牌的配方在規格內也有差，但更常見的是換品牌時配製條件也變了（溶解量、滅菌時間）。用標準菌株平行比較，新舊品牌各五片，看回收率。
平行平板差一倍，該重做嗎？ 菌落數都在範圍內而差一倍，超出統計變異，應該重做，並檢查稀釋液的混勻和吸管操作。
要用哪種蛋白腖配 0.1% 蛋白腖稀釋液？ 一般細菌學級蛋白腖即可，例如 Peptone, Bacteriological，食藥署食品方法與多數國際方法都是這樣寫。