要点
糖を含む培地であれば、121 °Cでのオートクレーブ後にpHが0.2～0.4下がるのは正常です。乾燥培地の規格書に記載された「最終pH」は滅菌後の値です。低下が0.5を超える場合や、培地が明らかに濃い色で出てくる場合は、過熱か、処方の糖とリン酸塩の負荷が高いことを意味し、滅菌サイクルの調整か成分の別滅菌が必要です。滅菌後に容器を開けてpHを再調整すると汚染のリスクが生じるため、処方上必要な場合に限ってください。
pHが下がる理由
三つの機構が、通常は同時に働きます。
- メイラード反応。 還元糖（グルコース、ラクトース）が高温でアミノ酸と反応し、有機酸と褐色物質を生成します。これが主な原因で、糖が多いほど、温度が高いほど、時間が長いほど、低下と着色は大きくなります。
- 糖のカラメル化と分解。 グルコース単独でも加熱により酸性の生成物に分解され、特にアルカリ性溶液中で顕著です。
- リン酸塩と二酸化炭素。 オートクレーブにより溶存CO₂が溶液から追い出されてpHが上がり、冷却時に再溶解してpHが戻ります。リン酸緩衝された培地ではこの段階の変動は小さく、緩衝されていない培地では大きく振れます。
つまり滅菌前と滅菌後のpHは別の数値であり、規格書と試験法は後者を示しています。培地を調製する際は、この低下を見込んで滅菌前のpHを設定します。多くの乾燥培地の説明書が「7.2に調整」ではなく「滅菌後pH 7.2 ± 0.2」と記載しているのはこのためです。
どの程度が正常か
| 培地の種類 | オートクレーブ後のpH低下 | 備考 |
|---|---|---|
| 糖なし（Nutrient Broth、BPW） | 0～0.1 | ほぼ変化なし |
| グルコース0.25～0.5%（TSB、TSA、標準寒天培地） | 0.1～0.3 | 正常 |
| グルコース2%（SDA、YPD、MRS） | 0.2～0.5 | 正常、やや濃色 |
| 糖4%以上、またはラクトース | 0.3～0.6以上 | 糖を別滅菌 |
これらの範囲を外れる場合は、まずオートクレーブを確認します。実際の温度が121 °Cを超えていないか、昇温と冷却が遅くないか（大きなボトルでは高温にさらされる時間が設定時間よりはるかに長くなります）、培地を二度オートクレーブしていないか。
成分を別滅菌すべき場合
- 糖が2%を超える発酵培地： 糖は濃縮液として滅菌するか0.2 µmでろ過し、冷却後に加えます。
- 高濃度のリン酸塩とマグネシウムまたはカルシウムの併用： 一緒にオートクレーブするとリン酸マグネシウムやリン酸カルシウムが白い沈殿として析出します。別々に滅菌してから合わせます。
- ビタミンと熱に弱い増殖因子： ろ過滅菌して加えます。オートクレーブは絶対に避けてください。
乾燥培地はこの点をすでに考慮して設計されています。指定された濃度と条件で調製すれば、別処理をしなくても規定のpH範囲に収まります。別滅菌は自社の発酵処方のためのものです。
滅菌後にpHを再調整すべきか
日常的な試験用培地では、不要です。容器を開けることは汚染の機会を一つ増やすことであり、規格は滅菌後の値を指しています。範囲内であれば合格です。
発酵培地では、滅菌後のpHが目標から0.2以上外れる場合、毎回滅菌後に補正するより、次のバッチが目標に収まるように滅菌前の設定値を変えるほうが良い対処です。どうしても補正が必要な場合は、ろ過滅菌した酸またはアルカリを無菌的に加えます。
調整の方法と使用する試薬は培地pHの調整をご覧ください。
よくある質問
pHが大きく下がり、培地の色もかなり濃くなりました。使えますか 濃い色はメイラード反応が広範に進んだことを意味し、糖が消費され、阻害物質もいくらか生成しています。試験用培地は作り直してください。発酵培地は菌株の耐性によりますが、通常は収量が落ちます。原因と対処はオートクレーブ後に培地が濃くなったり濁ったりするをご覧ください。
圧力鍋と実験用オートクレーブでpHの低下は違いますか 違います。実際の加熱時間が異なるためです。家庭用の圧力鍋は昇温が遅く冷却はさらに遅いため、培地は設定の15分よりはるかに長く高温にさらされます。1リットル以上のボトルでも同じことが起こります。設定時間を短くするか、小さいボトルを使ってください。
同じ乾燥培地なのにバッチごとにpHが違います。品質の問題ですか まずそれぞれが規定範囲内かを確認してください。同じ粉末ロットと同じオートクレーブであれば、バッチ間の変動は0.1以内に収まるはずです。0.2を超えるばらつきは通常、オートクレーブの積載量か水質（水道水の硬度とアルカリ度）に由来します。比較する前にこの二つの変数を整えてください。