要点
平板菌数のばらつきの大半は培地ではなく操作に由来します。最大の要因は四つです。希釈液（種類、温度、保持時間）、分注時の培地温度、採用するコロニー数の範囲、試料を均質化したかどうか。規格に適合した培地のロット間変動は通常10%未満ですが、操作は日常的に30～50%のばらつきを持ち込みます。まず操作を確認し、培地は最後に標準菌株で試験してください。
正常なばらつきを知る
平板菌数には統計的なばらつきが本来含まれています。同じ希釈段階の二枚の平板がどちらも30～300コロニーの範囲にある場合、ポアソン分布のもとでは10～20%の差が出るのが普通です。コロニーが10個しかない平板では、何も問題がなくても50%の差が出ることがあります。したがって最初の確認は、30～300（または試験法が指定する範囲）の平板同士を比較しているかどうかです。25未満の平板は計数すべきではありません。
影響の大きい順に確認する
1. 希釈液
- 種類。 試験法が指定するものを使います。0.1%ペプトン水、緩衝ペプトン水、リン酸緩衝液、生理食塩水では損傷した細胞の回復のしやすさが異なり、単なる水は浸透圧ショックで細胞を殺します。
- 温度。 冷蔵庫から出した直後の希釈液は細胞に低温ショックを与えます。室温に戻してください。
- 保持時間。 希釈から15～20分以内に分注を終えます。希釈液に放置した細胞は死ぬか増殖します。
- 容量。 オートクレーブで9 mLの希釈管が8.5 mLまで蒸発していると、一段階あたり5%、三段階で15%の誤差が生じます。滅菌後に容量を確認してください。
2. 分注温度
培地は44～46 °Cに保ちます。熱すぎる（48 °C超）と細胞の一部、特に損傷した細胞が死にます。冷たすぎると早く固まり、混合が不均一になります。ウォーターバスの温度計を校正し、ボトルをバスに入れてから本当に温度が揃うまで30分以上待ってください。
3. 平板の厚さと乾燥
15～20 mLを分注します。薄い平板は48時間で乾き、コロニーが小さいままになります。厚い平板は下層のコロニーを隠します。塗抹平板では、表面に水滴が残らなくなるまで乾かさないとコロニーが流れてつながります。
4. 培地の保存
分注済みの平板は乾燥を防ぐために袋に入れて冷蔵し、7～14日以内に使います。それ以上置いた平板は表面が乾燥し、菌数が低く出ます。開封した粉末は湿気を防ぐために密閉し直してください。乾燥培地の保存と有効期限をご覧ください。
5. 計数範囲と判読
試験法の記載どおり、25～250または30～300です。範囲内の希釈段階が一つだけならそれのみを使い、二つあるなら単純平均ではなく試験法の加重式を適用します。同じ分析者が同じ平板を再計数したときは5%以内、別の分析者では10%以内で一致するはずです。それを超える場合は判読基準（何を一つのコロニーとするか、スプレッダーの扱い）を揃えてください。
6. 培養条件
インキュベーターの温度は均一ではありません。上段と下段で2 °C違うことがあり、積み重ねた平板の中央は温まるのが遅くなります。2 °Cまたは4時間の差で、48時間の好気性菌数が20%動くことがあります。
7. 試料の均質化
均質化が不十分な固体試料や、振り混ぜていない液体では、取り出した1 mLが試料を代表しません。これは試料間のばらつきの最大の要因であり、培地とは無関係です。
8. 培地そのもの
以上をすべて除外してから、標準菌株で培地を試験します。ATCC菌株（たとえばE. coli ATCC 25922、S. aureus ATCC 25923）を定量的に接種し、旧ロットと新ロットそれぞれ5枚ずつで回収率を比較します。差が30%を超えるか、新ロットの回収率が試験法の要求を下回る場合は、培地の問題を示します。STBIOでは全ロットにCOAを添付しており、比較のための培養性能データも提供しています。
チェックリスト
| 項目 | 基準 |
|---|---|
| 希釈液 | 試験法が指定する種類、室温、滅菌後に容量を確認 |
| 希釈から分注まで | 20分以内 |
| 培地温度 | 44～46 °C、実測 |
| 分注量 | 15～20 mL |
| 平板の保存 | 冷蔵、袋入り、14日以内 |
| 計数範囲 | 試験法に従う。25未満は計数しない |
| インキュベーター | 校正済み。積み重ねは6枚まで |
| 対照 | 毎バッチに陽性対照菌株とブランク |
よくある質問
培地のブランドを替えたら菌数が下がりました。新しいブランドのほうが劣るのですか 必ずしもそうではありません。ブランド間には規格内での差がありますが、それ以上に多いのは、ブランドと一緒に調製条件（1リットルあたりのグラム数、滅菌時間）が変わっていることです。標準菌株でブランドごとに5枚ずつ並べて比較し、回収率を見てください。
二枚の平板で2倍の差が出ます。やり直すべきですか 両方の菌数が範囲内でなお2倍の差があるなら、統計的なばらつきを超えています。やり直し、希釈液の混合とピペット操作を確認してください。
0.1%ペプトン希釈液にはどのペプトンを使いますか 通常の細菌学用ペプトン、たとえばPeptone, Bacteriologicalです。台湾FDAの食品試験法と国際的な試験法の多くがこれを指定しています。