Jawapan ringkas
Kebanyakan variasi kiraan plat berpunca daripada teknik, bukan daripada media. Empat faktor terbesar: pencair (jenis, suhu, masa pegangan), suhu media semasa dituang, julat kiraan koloni yang anda terima, dan sama ada sampel telah dihomogenkan. Variasi antara lot bagi media yang memenuhi spesifikasi biasanya di bawah 10%, manakala teknik lazimnya memperkenalkan 30 hingga 50%. Selesaikan masalah teknik dahulu dan uji media dengan strain rujukan paling akhir.
Kenali rupa yang normal
Kiraan plat membawa variasi statistik yang wujud secara semula jadi. Dua plat duplikat pada pencairan yang sama, kedua-duanya dengan 30 hingga 300 koloni, lazimnya berbeza 10 hingga 20% di bawah taburan Poisson; plat dengan hanya 10 koloni boleh berbeza 50% tanpa ada apa-apa yang salah. Oleh itu pemeriksaan pertama ialah memastikan anda membandingkan plat dalam julat 30 hingga 300 (atau apa sahaja julat yang ditetapkan oleh kaedah); plat di bawah 25 tidak sepatutnya dikira sama sekali.
Memeriksa mengikut urutan kesan
1. Pencair
- Jenis. Gunakan apa yang ditetapkan oleh kaedah. Air pepton 0.1%, air pepton berpenimbal, penimbal fosfat dan salin fisiologi berbeza dari segi sejauh mana ia membolehkan sel yang cedera pulih; air biasa membunuh sel melalui kejutan osmotik.
- Suhu. Pencair yang terus keluar dari peti sejuk memberi kejutan sejuk kepada sel. Biarkan ia mencapai suhu bilik.
- Masa pegangan. Selesaikan penuangan dalam masa 15 hingga 20 minit selepas pencairan; sel mati atau membiak dalam pencair yang dibiarkan.
- Isi padu. Tiub pencairan 9 mL yang telah tersejat kepada 8.5 mL dalam autoklaf memperkenalkan ralat 5% setiap langkah, 15% bagi tiga langkah. Periksa isi padu selepas pensterilan.
2. Suhu penuangan
Kekalkan media pada 44 hingga 46 °C. Terlalu panas (melebihi 48 °C) membunuh sebahagian sel, terutamanya yang cedera; terlalu sejuk dan ia memejal awal serta bercampur tidak sekata. Tentukur termometer kukus air, dan beri masa 30 minit atau lebih selepas meletakkan botol dalam kukus air sebelum ia benar-benar mencapai suhu.
3. Kedalaman dan pengeringan plat
Tuang 15 hingga 20 mL. Plat yang nipis kering dalam masa 48 jam dan koloni kekal kecil; plat yang tebal menyembunyikan koloni di lapisan bawah. Bagi plat sebaran, keringkan permukaan sehingga tiada titisan tertinggal, jika tidak koloni akan bercantum.
4. Penyimpanan media
Gunakan plat yang telah dituang dalam masa 7 hingga 14 hari penyimpanan sejuk, dibungkus dalam beg untuk mengelakkan pengeringan; plat yang disimpan lebih lama mempunyai permukaan yang kering dan memberikan kiraan rendah. Tutup semula serbuk yang telah dibuka untuk mengelakkan lembapan; lihat Penyimpanan media kering dan jangka hayat.
5. Julat kiraan dan pembacaan
25 hingga 250 atau 30 hingga 300, seperti yang dinyatakan oleh kaedah. Jika hanya satu pencairan dalam julat, gunakan yang itu sahaja; jika dua, gunakan formula berwajaran kaedah dan bukannya purata mudah. Penganalisis yang sama mengira semula plat yang sama sepatutnya bersetuju dalam 5%, penganalisis berbeza dalam 10%; melebihi itu, selaraskan kriteria pembacaan (apa yang dikira sebagai satu koloni, cara menangani koloni merebak).
6. Keadaan pengeraman
Suhu inkubator tidak seragam; rak atas dan bawah boleh berbeza 2 °C, dan timbunan plat memanas dengan perlahan di bahagian tengah. Perbezaan 2 °C atau 4 jam boleh mengubah kiraan aerobik 48 jam sebanyak 20%.
7. Penghomogenan sampel
Sampel pepejal yang tidak dihomogenkan sepenuhnya atau cecair yang tidak digoncang menjadikan 1 mL yang anda ambil tidak mewakili. Ini sumber variasi antara sampel yang terbesar dan tiada kaitan dengan media.
8. Media itu sendiri
Hanya selepas perkara di atas ditolak, uji media dengan strain rujukan. Inokulasi secara kuantitatif dengan strain ATCC (contohnya E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25923), lima plat setiap satu bagi lot lama dan baharu, dan bandingkan pemulihan. Perbezaan melebihi 30%, atau pemulihan pada lot baharu di bawah apa yang dikehendaki oleh kaedah, menunjukkan masalah media. STBIO menghantar COA bersama setiap lot dan data tindak balas kultur tersedia untuk perbandingan.
Senarai semak
| Perkara | Standard |
|---|---|
| Pencair | Jenis yang ditetapkan oleh kaedah, suhu bilik, isi padu diperiksa selepas pensterilan |
| Pencairan hingga penuangan | Dalam masa 20 minit |
| Suhu media | 44 hingga 46 °C, diukur |
| Isi padu tuangan | 15 hingga 20 mL |
| Penyimpanan plat | Disejukkan, dibungkus dalam beg, dalam masa 14 hari |
| Julat kiraan | Mengikut kaedah; jangan sekali-kali di bawah 25 |
| Inkubator | Ditentukur; timbunan tidak melebihi 6 plat |
| Kawalan | Strain kawalan positif dan blank bagi setiap kelompok |
Soalan lazim
Kiraan menurun selepas menukar jenama media. Adakah jenama baharu lebih teruk? Tidak semestinya. Jenama berbeza dalam lingkungan spesifikasi, tetapi lebih kerap penyediaan berubah bersama jenama (gram seliter, masa pensterilan). Bandingkan secara bersebelahan dengan strain rujukan, lima plat setiap jenama, dan perhatikan pemulihan.
Plat duplikat berbeza dua kali ganda. Ulang? Jika kedua-dua kiraan dalam julat dan masih berbeza dua kali ganda, itu melebihi variasi statistik; ulang, dan periksa pencampuran pencair dan teknik pemipetan.
Pepton mana untuk pencair pepton 0.1%? Pepton bakteriologi biasa, contohnya Peptone, Bacteriological; inilah yang ditetapkan oleh kaedah makanan Taiwan FDA dan kebanyakan kaedah antarabangsa.