Jawapan ringkas
Punca fasa lag yang panjang yang paling lazim, mengikut urutan: kultur benih pada umur yang salah (terlalu tua atau terlalu muda), perbezaan terlalu besar antara media benih dan media pengeluaran (sel perlu menyesuaikan diri semula), inokulum terlalu kecil, perencat yang terhasil daripada pensterilan media yang berlebihan, unsur surih atau vitamin yang tiada, tekanan osmotik terlalu tinggi, dan suhu atau pH di luar julat. Periksa benih dahulu: ia paling kerap terlepas pandang dan paling mudah diubah. Masalah media biasanya muncul dalam satu set kecil kawalan kelalang goncang yang dijalankan serentak.
1. Keadaan benih
- Umur. Benih yang diambil pada akhir fasa log memberikan fasa lag yang paling pendek. Benih yang dibiarkan masuk ke fasa pegun mengandungi sel yang sudah menuju kematian dan perlu membaiki diri sebelum tumbuh; benih yang terlalu muda kurang ketumpatan. Bagi kebanyakan bakteria, pindahkan apabila OD mencapai 70 hingga 80% daripada maksimumnya.
- Bilangan pasaj. Pasaj kedua atau ketiga daripada vial beku adalah yang paling stabil. Menginokulasi media pengeluaran terus daripada kriovial atau agar condong sentiasa memberikan fasa lag yang panjang.
- Kecederaan. Pengemparan, penyimpanan sejuk dan goncangan kuat meletakkan sel dalam mod pembaikan.
2. Media benih dan media pengeluaran terlalu berbeza
Apabila sel berpindah daripada media benih ke media pengeluaran dengan sumber nitrogen yang berbeza, gula yang berbeza, pH dan tekanan osmotik yang berbeza, ia perlu mensintesis satu set enzim baharu sebelum boleh makan. Contoh biasa: benih dalam TSB atau LB, pengeluaran dalam media tertakrif berasaskan ammonium sulfat; atau benih pada glukosa, pengeluaran pada sukrosa atau laktosa.
Penyelesaian: dekatkan media benih kepada media pengeluaran sedekat mungkin, sekurang-kurangnya kelas sumber nitrogen dan karbon yang sama; atau tambah satu peringkat benih dalam media "separuh pengeluaran" sebagai jambatan.
3. Saiz inokulum
Di bawah kira-kira 1% (v/v), fasa lag memanjang dengan ketara, kerana sel perlu mengkondisikan media dahulu (keupayaan redoks, beberapa komponen surih) dan sel yang lebih sedikit melakukannya dengan lebih perlahan. Kebanyakan fermentasi menggunakan 5 hingga 10%; organisma yang sukar melebihi 10%.
4. Perencat daripada pensterilan
Hasil Maillard daripada gula dan asid amino, fosfat dan ion logam yang termendak, serta peroksida daripada pemanasan berlebihan semuanya memanjangkan fasa lag atau merencat pertumbuhan sepenuhnya. Ujian: formulasi yang sama dengan gula diautoklaf secara berasingan atau ditambah melalui penapisan, dibandingkan dari segi fasa lag. Perbezaan yang jelas menunjukkan pensterilan sebagai punca. Lihat Media menjadi gelap atau keruh selepas autoklaf.
5. Unsur surih atau faktor pertumbuhan yang tiada
Paling lazim dalam media tertakrif atau media yang berasaskan terutamanya nitrogen tak organik. Kekurangan magnesium, ferum, mangan atau zink, atau vitamin B atau biotin, tidak menghentikan pertumbuhan sel; sel tumbuh dengan sangat perlahan. Bakteria asid laktik yang kekurangan mangan dan yis yang kekurangan biotin ialah kes klasik. Ujian pantas: tambah 0.1 hingga 0.3% ekstrak yis. Jika fasa lag memendek dengan ketara, faktor pertumbuhan atau unsur surih tiada; kemudian kecilkan skop untuk mengenal pasti yang mana.
6. Tekanan osmotik
Jumlah gula dan garam yang tinggi (contohnya fermentasi kelompok dengan semua gula ditambah pada awal) memaksa sel menyesuaikan diri dengan osmolariti tinggi dahulu. Bagi formulasi melebihi 5% gula, pertimbangkan fed-batch; dari segi garam, periksa sama ada fosfat dan ammonium sulfat telah terlebih dos untuk penimbalan.
7. Suhu dan pH
Media belum mencapai suhu yang ditetapkan semasa diinokulasi (bekas besar menyejuk dengan perlahan selepas pensterilan dan bahagian tengahnya kekal panas), atau pH selepas pensterilan di luar julat strain. Baca nilai sebenar pada saat inokulasi, bukan titik set. Bagi pH, lihat pH media menurun selepas autoklaf.
Mencari punca dengan cepat
Mengubah satu faktor pada satu masa adalah perlahan. Jalankan satu set kelalang kecil secara serentak:
- Formulasi asal + benih asal (kawalan)
- Formulasi asal + benih fasa log yang segar
- Formulasi asal + inokulum dua kali ganda
- Formulasi asal + 0.2% ekstrak yis
- Formulasi asal dengan gula disterilkan secara berasingan
Kelalang mana yang memendekkan fasa lag dengan jelas menunjukkan puncanya, dalam masa sehari.
Soalan lazim
Fasa lag panjang tetapi hasil akhir normal. Perlukah saya membetulkannya? Ini soal kos. Empat jam tambahan fasa lag bermaksud empat jam lagi penggunaan bekas, kuasa pengudaraan dan pengadukan, dan lebih banyak risiko pencemaran. Hasil normal dengan fasa lag yang panjang paling kerap berpunca daripada umur benih; laraskan titik pemindahan.
Strain yang sama tumbuh cepat pada pepton lama dan mengalami fasa lag pada pepton baharu. Mengapa? Lot atau jenama yang berbeza mempunyai darjah hidrolisis yang berbeza. Dengan peptida kecil dan asid amino bebas yang lebih sedikit, sel perlu merembeskan protease dahulu untuk memecahkan molekul yang lebih besar sebelum dapat menggunakannya, jadi fasa lag memanjang. Semak nisbah nitrogen amino pada COA, atau lihat Hasil menurun selepas menukar lot pepton.
Adakah menambah ekstrak yis akan mengubah spesifikasi produk saya? Ia menambah satu bahan mentah; proses gred makanan perlu mengesahkan asal dan dokumentasinya. Ekstrak yis dan pepton yis STBIO adalah gred makanan dengan COA bagi setiap lot; lihat pepton yis.