Jawapan ringkas
Penurunan 0.2 hingga 0.4 unit pH selepas autoklaf pada 121 °C adalah normal bagi mana-mana media yang mengandungi gula; "pH akhir" pada helaian spesifikasi media kering ialah nilai selepas pensterilan. Penurunan melebihi 0.5, atau media yang keluar dengan warna yang ketara lebih gelap, bermaksud ia terlebih panas atau formulasinya membawa beban gula dan fosfat yang tinggi, dan anda perlu melaraskan kitaran atau mensterilkan komponen secara berasingan. Membuka bekas untuk melaraskan semula pH selepas pensterilan menimbulkan risiko pencemaran; lakukan hanya apabila formulasi memerlukannya.
Mengapa pH menurun
Tiga mekanisme, biasanya berlaku serentak:
- Tindak balas Maillard. Gula penurun (glukosa, laktosa) bertindak balas dengan asid amino pada suhu tinggi, menghasilkan asid organik dan sebatian perang. Ini punca utama: lebih banyak gula, suhu lebih tinggi dan masa lebih lama semuanya menambah penurunan dan warna.
- Pengaramelan dan penguraian gula. Glukosa sendiri terurai menjadi hasil berasid apabila dipanaskan, terutamanya dalam larutan beralkali.
- Fosfat dan karbon dioksida. Autoklaf menyingkirkan CO₂ terlarut daripada larutan, menaikkan pH; semasa penyejukan ia larut semula dan pH kembali turun. Media berpenimbal fosfat bergerak sedikit sahaja dalam langkah ini; media tanpa penimbal berayun lebih banyak.
Oleh itu pH sebelum dan selepas pensterilan ialah dua angka yang berbeza, dan helaian spesifikasi serta kaedah ujian menyebut angka yang kedua. Semasa menyediakan media, tetapkan pH prapensterilan dengan mengambil kira penurunan itu. Itulah sebabnya kebanyakan arahan media kering menyatakan "pH 7.2 ± 0.2 selepas pensterilan" dan bukannya "laraskan kepada 7.2".
Berapa banyak yang normal
| Jenis media | Penurunan pH selepas autoklaf | Nota |
|---|---|---|
| Tanpa gula (kaldu nutrien, BPW) | 0 hingga 0.1 | Hampir tidak berubah |
| 0.25 hingga 0.5% glukosa (TSB, TSA, PCA) | 0.1 hingga 0.3 | Normal |
| 2% glukosa (SDA, YPD, MRS) | 0.2 hingga 0.5 | Normal, sedikit lebih gelap |
| 4% gula atau lebih, atau laktosa | 0.3 hingga 0.6 atau lebih | Sterilkan gula secara berasingan |
Di luar julat ini, periksa autoklaf dahulu: adakah suhu sebenar melebihi 121 °C, adakah pemanasan dan penyejukan perlahan (dalam botol besar, masa pada suhu tinggi jauh lebih lama daripada masa yang ditetapkan), adakah media telah diautoklaf dua kali?
Bila komponen perlu disterilkan secara berasingan
- Media fermentasi dengan gula melebihi 2%: sterilkan gula sebagai larutan pekat, atau tapis melalui 0.2 µm, dan tambah selepas penyejukan.
- Fosfat tinggi bersama magnesium atau kalsium: mengautoklafnya bersama-sama memendakkan magnesium dan kalsium fosfat sebagai endapan putih; sterilkan secara berasingan dan gabungkan.
- Vitamin dan faktor pertumbuhan yang sensitif haba: sterilkan dengan penapisan dan tambah; jangan sekali-kali diautoklaf.
Media kering sudah mengambil kira perkara ini. Disediakan pada kepekatan dan keadaan yang dinyatakan, ia akan berada dalam julat pH yang ditetapkan tanpa rawatan berasingan. Pensterilan berasingan adalah untuk formulasi fermentasi dalaman.
Perlukah pH dilaraskan semula selepas pensterilan?
Bagi media ujian rutin: tidak. Membuka bekas ialah satu lagi peluang pencemaran, dan spesifikasi merujuk kepada nilai pascapensterilan; dalam julat bermaksud boleh diterima.
Bagi media fermentasi: jika pH pascapensterilan tersasar daripada sasaran melebihi 0.2, pembetulan yang lebih baik ialah mengubah titik set prapensterilan supaya kelompok seterusnya mencapai sasaran, dan bukannya membetulkan setiap kelompok selepas itu. Jika anda terpaksa membetulkannya, tambah asid atau bes yang disterilkan dengan penapisan dalam keadaan aseptik.
Cara melaraskan dan dengan apa: Melaraskan pH media kultur.
Soalan lazim
pH menurun banyak dan media menjadi jauh lebih gelap. Bolehkah saya masih menggunakannya? Warna gelap bermaksud tindak balas Maillard yang meluas: gula telah digunakan dan sebahagian sebatian perencat telah terbentuk. Sediakan semula media ujian. Bagi media fermentasi, ia bergantung pada toleransi strain, tetapi hasil biasanya terjejas. Punca dan penyelesaian: Media menjadi gelap atau keruh selepas autoklaf.
Adakah periuk tekanan memberi penurunan pH yang berbeza daripada autoklaf makmal? Ya, disebabkan masa pemanasan sebenar. Periuk tekanan domestik memanas dengan perlahan dan menyejuk dengan lebih perlahan lagi, jadi media berada pada suhu tinggi jauh lebih lama daripada 15 minit yang ditetapkan. Perkara yang sama terpakai bagi botol 1 liter atau lebih; pendekkan masa yang ditetapkan atau gunakan botol yang lebih kecil.
Setiap kelompok media kering yang sama keluar pada pH yang berbeza. Adakah ini masalah kualiti? Periksa dahulu sama ada setiap satu berada dalam julat yang ditetapkan. Dengan lot serbuk yang sama dan autoklaf yang sama, variasi antara kelompok sepatutnya dalam 0.1. Sebaran melebihi 0.2 biasanya berpunca daripada muatan autoklaf atau kualiti air (keliatan dan kealkalian air paip); betulkan kedua-dua pemboleh ubah itu sebelum membuat perbandingan.