ผลนับจำนวนโคโลนีแกว่งมากระหว่างรอบ: เป็นที่อาหารเลี้ยงเชื้อหรือไม่? แปดตัวแปรที่ต้องตัดออก

คำตอบโดยสรุป

ความแปรปรวนของผลนับจำนวนโคโลนีส่วนใหญ่มาจากเทคนิค ไม่ใช่จากอาหารเลี้ยงเชื้อ สี่ปัจจัยที่ใหญ่ที่สุด: สารละลายเจือจาง (ชนิด อุณหภูมิ เวลาที่ตั้งทิ้งไว้) อุณหภูมิของอาหารเลี้ยงเชื้อขณะเท ช่วงจำนวนโคโลนีที่คุณยอมรับ และตัวอย่างถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวหรือไม่ ความแปรปรวนระหว่างล็อตของอาหารเลี้ยงเชื้อที่ผ่านข้อกำหนดมักต่ำกว่า 10% ขณะที่เทคนิคสร้างความแปรปรวน 30 ถึง 50% เป็นประจำ ให้แก้เทคนิคก่อนและทดสอบอาหารเลี้ยงเชื้อด้วยสายพันธุ์อ้างอิงเป็นลำดับสุดท้าย

รู้ว่าค่าปกติเป็นอย่างไร

ผลนับจำนวนโคโลนีมีความแปรปรวนทางสถิติในตัว จานซ้ำสองจานที่ระดับเจือจางเดียวกันซึ่งมี 30 ถึง 300 โคโลนีทั้งคู่ ตามปกติต่างกัน 10 ถึง 20% ตามการแจกแจงปัวซง จานที่มีเพียง 10 โคโลนีอาจต่างกัน 50% โดยไม่มีอะไรผิดปกติ ดังนั้นสิ่งแรกที่ต้องตรวจคือคุณกำลังเทียบจานที่อยู่ในช่วง 30 ถึง 300 (หรือช่วงที่วิธีกำหนด) จานที่ต่ำกว่า 25 ไม่ควรนับเลย

ตรวจตามลำดับผลกระทบ

1. สารละลายเจือจาง

• ชนิด ใช้ตามที่วิธีกำหนด 0.1% peptone water, buffered peptone water, บัฟเฟอร์ฟอสเฟต และน้ำเกลือทางสรีรวิทยา ต่างกันในความสามารถให้เซลล์ที่บาดเจ็บฟื้นตัว น้ำเปล่าทำให้เซลล์ตายจากออสโมติกช็อก
• อุณหภูมิ สารละลายเจือจางที่เพิ่งออกจากตู้เย็นทำให้เซลล์ช็อกจากความเย็น ปล่อยให้ถึงอุณหภูมิห้องก่อน
• เวลาที่ตั้งทิ้งไว้ เทจานให้เสร็จภายใน 15 ถึง 20 นาทีหลังเจือจาง เซลล์จะตายหรือเพิ่มจำนวนในสารละลายเจือจางที่ตั้งทิ้งไว้
• ปริมาตร หลอดเจือจาง 9 mL ที่ระเหยเหลือ 8.5 mL ในหม้อนึ่งความดัน สร้างความคลาดเคลื่อน 5% ต่อขั้น และ 15% ในสามขั้น ตรวจปริมาตรหลังฆ่าเชื้อ

2. อุณหภูมิขณะเท

รักษาอาหารเลี้ยงเชื้อไว้ที่ 44 ถึง 46 °C ร้อนเกิน (สูงกว่า 48 °C) ฆ่าเซลล์บางส่วน โดยเฉพาะเซลล์ที่บาดเจ็บ เย็นเกินจะแข็งตัวก่อนและผสมไม่ทั่ว สอบเทียบเทอร์โมมิเตอร์ของอ่างน้ำ และให้เวลา 30 นาทีขึ้นไปหลังวางขวดในอ่างก่อนจะถึงอุณหภูมิจริง

3. ความหนาของจานและการทำให้แห้ง

เท 15 ถึง 20 mL จานบางจะแห้งภายใน 48 ชั่วโมงและโคโลนีเล็ก จานหนาซ่อนโคโลนีในชั้นล่าง สำหรับการเกลี่ยบนผิววุ้น ให้ทำผิวแห้งจนไม่มีหยดน้ำ มิฉะนั้นโคโลนีจะไหลรวมกัน

4. การเก็บอาหารเลี้ยงเชื้อ

ใช้จานที่เทแล้วภายใน 7 ถึง 14 วันเมื่อแช่เย็น ใส่ถุงกันแห้ง จานที่เก็บนานกว่านั้นผิวแห้งและให้ผลนับต่ำ ปิดผงที่เปิดแล้วให้สนิทกันความชื้น ดูการเก็บอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดผงและอายุการเก็บ

5. ช่วงการนับและการอ่านผล

25 ถึง 250 หรือ 30 ถึง 300 ตามที่วิธีระบุ หากมีระดับเจือจางเดียวอยู่ในช่วง ให้ใช้ระดับนั้นเท่านั้น หากมีสองระดับ ให้ใช้สูตรถ่วงน้ำหนักของวิธีแทนค่าเฉลี่ยธรรมดา ผู้วิเคราะห์คนเดียวนับจานเดิมซ้ำควรตรงกันภายใน 5% ต่างคนภายใน 10% หากเกินกว่านั้น ให้ปรับเกณฑ์การอ่านให้ตรงกัน (อะไรนับเป็นหนึ่งโคโลนี จัดการ spreader อย่างไร)

6. เงื่อนไขการบ่ม

อุณหภูมิในตู้บ่มไม่สม่ำเสมอ ชั้นบนและชั้นล่างอาจต่างกัน 2 °C และกองจานจะอุ่นช้าตรงกลาง ความต่าง 2 °C หรือ 4 ชั่วโมงสามารถเลื่อนผลนับแอโรบิก 48 ชั่วโมงได้ 20%

7. การทำให้ตัวอย่างเป็นเนื้อเดียว

ตัวอย่างของแข็งที่ทำให้เป็นเนื้อเดียวไม่สมบูรณ์หรือของเหลวที่ไม่ได้เขย่า ทำให้ 1 mL ที่ตักไปไม่เป็นตัวแทน นี่คือแหล่งความแปรปรวนระหว่างตัวอย่างที่ใหญ่ที่สุดและไม่เกี่ยวกับอาหารเลี้ยงเชื้อเลย

8. อาหารเลี้ยงเชื้อเอง

เมื่อตัดข้อข้างต้นออกแล้วเท่านั้น จึงทดสอบอาหารเลี้ยงเชื้อด้วยสายพันธุ์อ้างอิง ใส่เชื้อ ATCC ในปริมาณที่กำหนด (เช่น E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25923) ล็อตเก่าและล็อตใหม่อย่างละห้าจาน แล้วเทียบการฟื้นตัว ความต่างเกิน 30% หรือการฟื้นตัวบนล็อตใหม่ต่ำกว่าที่วิธีกำหนด ชี้ว่าเป็นปัญหาของอาหารเลี้ยงเชื้อ STBIO ส่ง COA พร้อมทุกล็อตและมีข้อมูลการตอบสนองของเชื้อให้เทียบ

รายการตรวจสอบ

คำถามที่พบบ่อย

ผลนับลดลงหลังเปลี่ยนยี่ห้ออาหารเลี้ยงเชื้อ ยี่ห้อใหม่แย่กว่าหรือไม่? ไม่จำเป็น ยี่ห้อต่างกันภายในข้อกำหนด แต่บ่อยกว่านั้นคือการเตรียมเปลี่ยนไปพร้อมยี่ห้อ (กรัมต่อลิตร เวลาฆ่าเชื้อ) เทียบเคียงกันด้วยสายพันธุ์อ้างอิง ยี่ห้อละห้าจาน แล้วดูการฟื้นตัว

จานซ้ำต่างกันสองเท่า ต้องทำซ้ำไหม? หากทั้งสองค่าอยู่ในช่วงแต่ยังต่างกันสองเท่า นั่นเกินความแปรปรวนทางสถิติ ให้ทำซ้ำ และตรวจการผสมสารละลายเจือจางกับเทคนิคการใช้ปิเปต

ใช้เปปโตนชนิดใดสำหรับสารละลายเจือจาง 0.1% peptone? เปปโตนแบคทีเรียวิทยาทั่วไป เช่น Peptone, Bacteriological นี่คือสิ่งที่วิธีตรวจอาหารของ Taiwan FDA และวิธีสากลส่วนใหญ่กำหนด