ระยะปรับตัวยาวหลังใส่หัวเชื้อและไม่มีอะไรเจริญ: ต้องตรวจอะไรบ้าง

คำตอบโดยสรุป

สาเหตุที่พบบ่อยที่สุดของระยะปรับตัวที่ยาว เรียงตามลำดับ: หัวเชื้ออายุไม่เหมาะ (แก่เกินหรืออ่อนเกิน) อาหารเลี้ยงหัวเชื้อกับอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับการผลิตต่างกันมากเกินไป (เซลล์ต้องปรับตัวใหม่) หัวเชื้อน้อยเกิน สารยับยั้งที่เกิดจากการฆ่าเชื้ออาหารเลี้ยงเชื้อมากเกินไป ขาดธาตุปริมาณน้อยหรือวิตามิน ความดันออสโมติกสูงเกิน และอุณหภูมิหรือ pH อยู่นอกช่วง ตรวจหัวเชื้อก่อน: เป็นสิ่งที่มองข้ามบ่อยที่สุดและแก้ง่ายที่สุด ปัญหาจากอาหารเลี้ยงเชื้อมักปรากฏในชุดควบคุมขวดเขย่าเล็ก ๆ ที่ทำควบคู่กัน

1. สภาพหัวเชื้อ

• อายุ หัวเชื้อที่เก็บในช่วงปลายระยะเจริญแบบลอการิทึมให้ระยะปรับตัวสั้นที่สุด หัวเชื้อที่ทิ้งไว้จนเข้าระยะคงที่มีเซลล์ที่กำลังเข้าสู่การตายซึ่งต้องซ่อมแซมตัวเองก่อนจึงเจริญได้ หัวเชื้อที่อ่อนเกินมีความหนาแน่นไม่พอ สำหรับแบคทีเรียส่วนใหญ่ ให้ถ่ายเชื้อเมื่อ OD ถึง 70 ถึง 80% ของค่าสูงสุด
• จำนวนครั้งการถ่ายเชื้อ รุ่นที่สองหรือสามจากหลอดแช่แข็งคงที่ที่สุด การใส่หัวเชื้อลงอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับการผลิตโดยตรงจากหลอดแช่แข็งหรือ slant ให้ระยะปรับตัวยาวเสมอ
• การบาดเจ็บ การปั่นเหวี่ยง การเก็บในที่เย็น และการเขย่าอย่างรุนแรงทำให้เซลล์เข้าสู่โหมดซ่อมแซม

2. อาหารเลี้ยงหัวเชื้อกับอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับการผลิตต่างกันเกินไป

เมื่อเซลล์ย้ายจากอาหารเลี้ยงหัวเชื้อไปยังอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับการผลิตที่มีแหล่งไนโตรเจนต่างกัน น้ำตาลต่างกัน pH และความดันออสโมติกต่างกัน เซลล์ต้องสังเคราะห์เอนไซม์ชุดใหม่ก่อนจึงกินอาหารได้ ตัวอย่างที่พบบ่อย: หัวเชื้อใน TSB หรือ LB แต่ผลิตในอาหารเลี้ยงเชื้อสูตรกำหนดที่ใช้แอมโมเนียมซัลเฟต หรือหัวเชื้อบนกลูโคส แต่ผลิตบนซูโครสหรือแลคโตส

วิธีแก้: ทำให้อาหารเลี้ยงหัวเชื้อใกล้เคียงอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับการผลิตให้มากที่สุด อย่างน้อยให้แหล่งไนโตรเจนและคาร์บอนเป็นกลุ่มเดียวกัน หรือเพิ่มขั้นหัวเชื้อในอาหารเลี้ยงเชื้อ "กึ่งผลิต" เป็นสะพานเชื่อม

3. ปริมาณหัวเชื้อ

ต่ำกว่าประมาณ 1% (v/v) ระยะปรับตัวยาวขึ้นเห็นได้ชัด เพราะเซลล์ต้องปรับสภาพอาหารเลี้ยงเชื้อก่อน (ศักย์รีดอกซ์ ส่วนประกอบปริมาณน้อยบางชนิด) และเซลล์จำนวนน้อยทำได้ช้ากว่า การหมักส่วนใหญ่ใช้ 5 ถึง 10% จุลินทรีย์ที่เลี้ยงยากใช้มากกว่า 10%

4. สารยับยั้งจากการฆ่าเชื้อ

ผลิตภัณฑ์ Maillard จากน้ำตาลและกรดอะมิโน ฟอสเฟตและไอออนโลหะที่ตกตะกอน และเปอร์ออกไซด์จากความร้อนสูงเกิน ล้วนทำให้ระยะปรับตัวยาวขึ้นหรือยับยั้งการเจริญโดยตรง ทดสอบ: สูตรเดิมแต่นึ่งน้ำตาลแยกหรือเติมแบบกรอง แล้วเทียบระยะปรับตัว ความต่างที่ชัดเจนชี้ไปที่การฆ่าเชื้อ ดูอาหารเลี้ยงเชื้อเปลี่ยนเป็นสีเข้มหรือขุ่นหลังนึ่งฆ่าเชื้อ

5. ขาดธาตุปริมาณน้อยหรือปัจจัยการเจริญ

พบบ่อยที่สุดในอาหารเลี้ยงเชื้อสูตรกำหนดหรืออาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้ไนโตรเจนอนินทรีย์เป็นหลัก เมื่อขาดแมกนีเซียม เหล็ก แมงกานีส หรือสังกะสี หรือขาดวิตามินบีหรือไบโอทิน เซลล์ไม่หยุดเจริญ แต่เจริญช้ามาก แบคทีเรียกรดแลคติกที่ขาดแมงกานีสและยีสต์ที่ขาดไบโอทินเป็นกรณีคลาสสิก ทดสอบอย่างเร็ว: เติมสารสกัดจากยีสต์ 0.1 ถึง 0.3% หากระยะปรับตัวสั้นลงอย่างมาก แสดงว่าขาดปัจจัยการเจริญหรือธาตุปริมาณน้อย แล้วค่อยหาต่อว่าตัวใด

6. ความดันออสโมติก

น้ำตาลรวมกับเกลือในปริมาณสูง (เช่น การหมักแบบ batch ที่ใส่น้ำตาลทั้งหมดตั้งแต่ต้น) บังคับให้เซลล์ต้องปรับตัวต่อออสโมลาริตีสูงก่อน สำหรับสูตรที่น้ำตาลเกิน 5% ให้พิจารณา fed-batch ฝั่งเกลือให้ตรวจว่าใส่ฟอสเฟตและแอมโมเนียมซัลเฟตมากเกินเพื่อเป็นบัฟเฟอร์หรือไม่

7. อุณหภูมิและ pH

อาหารเลี้ยงเชื้อยังไม่ถึงอุณหภูมิที่ตั้งเมื่อใส่หัวเชื้อ (ถังใหญ่เย็นช้าหลังฆ่าเชื้อและแกนกลางยังร้อน) หรือ pH หลังฆ่าเชื้ออยู่นอกช่วงของสายพันธุ์ อ่านค่าจริง ณ เวลาที่ใส่หัวเชื้อ ไม่ใช่ค่าที่ตั้งไว้ เรื่อง pH ดูpH ของอาหารเลี้ยงเชื้อลดลงหลังนึ่งฆ่าเชื้อ

หาสาเหตุอย่างรวดเร็ว

การเปลี่ยนทีละปัจจัยช้า ให้ทำขวดเล็กหนึ่งชุดพร้อมกัน:

1. สูตรเดิม + หัวเชื้อเดิม (ควบคุม)
2. สูตรเดิม + หัวเชื้อใหม่ในระยะเจริญแบบลอการิทึม
3. สูตรเดิม + หัวเชื้อสองเท่า
4. สูตรเดิม + สารสกัดจากยีสต์ 0.2%
5. สูตรเดิมแต่ฆ่าเชื้อน้ำตาลแยก

ขวดใดที่ระยะปรับตัวสั้นลงชัดเจนจะชี้สาเหตุได้ภายในหนึ่งวัน

คำถามที่พบบ่อย

ระยะปรับตัวยาวแต่ผลผลิตสุดท้ายปกติ ต้องแก้ไหม? เป็นคำถามเรื่องต้นทุน ระยะปรับตัวที่เพิ่มขึ้นสี่ชั่วโมงคือการใช้ถังเพิ่มสี่ชั่วโมง พลังงานการให้อากาศและการกวนเพิ่ม และความเสี่ยงปนเปื้อนมากขึ้น ผลผลิตปกติแต่ระยะปรับตัวยาวมักเป็นเรื่องอายุหัวเชื้อ ปรับจุดถ่ายเชื้อ

สายพันธุ์เดียวกันเจริญเร็วบนเปปโตนเดิมแต่ปรับตัวนานบนเปปโตนใหม่ ทำไม? ล็อตหรือยี่ห้อที่ต่างกันมีระดับการย่อยสลายต่างกัน เมื่อมีเปปไทด์สายสั้นและกรดอะมิโนอิสระน้อยกว่า เซลล์ต้องหลั่งโปรตีเอสเพื่อย่อยโมเลกุลขนาดใหญ่ก่อนจึงใช้ได้ ระยะปรับตัวจึงยาวขึ้น ตรวจอัตราส่วนอะมิโนไนโตรเจนใน COA หรือดูผลผลิตลดลงหลังเปลี่ยนล็อตเปปโตน

การเติมสารสกัดจากยีสต์จะเปลี่ยนข้อกำหนดผลิตภัณฑ์ของฉันไหม? เป็นการเพิ่มวัตถุดิบหนึ่งรายการ กระบวนการเกรดอาหารต้องยืนยันแหล่งที่มาและเอกสาร สารสกัดจากยีสต์และเปปโตนจากยีสต์ของ STBIO เป็นเกรดอาหารและมี COA ทุกล็อต ดูเปปโตนจากยีสต์